【干货分享】sgRNA设计与筛选
02
切割位点与编辑位点的距离越近越好
插入位点或点突变位点尽可能靠近sgRNA的切割位点，以保证同源重组的效率。已有的研究表明，编辑效率与距离呈明显的单调负相关。一般而言，理想的距离是在10 bp以内。如果超过这个距离，重组效率会大大降低。
图1. 编辑效率与距离呈单调反比关系 04
脱靶风险评估
为了最大限度降低脱靶风险，可以采用以下的策略：
① 优化sgRNA设计
这是最根本的环节。利用专业软件设计sgRNA，优先选择在全基因组中唯一性高的序列，并考虑GC含量、避免连续重复序列等，从源头上提升特异性。
② 选择高保真Cas9变体
目前已开发出多种“高保真”版本的Cas9蛋白（如SpCas9-HF1、eSpCas9），这些变体对sgRNA与DNA配对的准确性要求更高，从而显著降低了容错率，有效减轻脱靶效应。
③ 改进递送方式与控制表达时间
采用瞬时转染的方式（如直接递送核糖核蛋白复合体RNP）而非使用持久表达的质粒，可以缩短Cas9/sgRNA在细胞内的作用时间，减少“误伤”机会。
④ 采用全面的脱靶检测技术
采用脱靶检测技术（如GUIDE-seq, OGM等）进行全方位评估，能够真实地反映基因编辑的安全性。
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