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CRISPR如何实现“定点修复” – 太阳集团城9661基因

【干货分享】CRISPR如何实现“定点修复”

CRISPR/Cas9系统的作用机制

CRISPR/Cas9系统的核心在于其能够利用sgRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂。
这种定向DNA断裂会触发细胞自身的修复机制，主要包括两种途径：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)。

✅ NHEJ修复途径往往导致插入或缺失突变(indels)，适用于基因敲除；
✅ 而HDR途径则能够利用外源提供的DNA模板进行精确修复，为实现点突变和基因敲入提供了基础。

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HDR：细胞自带的“精准修复系统”

同源重组修复（HDR）是细胞一种高保真度的DNA双链断裂（DSB）修复机制。它利用同源DNA序列作为模板进行精确修复，是基因敲入和点突变细胞株构建的核心技术基础。过程包括：

1）DNA双链断裂的形成与识别
CRISPR-Cas9在sgRNA引导下切割靶DNA，MRN复合物识别断端并启动修复。

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2）末端切除（End Resection）
BRCA1/MRN/CtIP复合物从5'端切除DNA，生成3'单链悬垂，为HDR奠定方向。

3）单链DNA结合与RAD51置换
RPA先结合ssDNA防止降解，随后RAD51取代RPA形成重组丝状体，为同源搜索做准备。

4）链入侵与DNA合成
RAD51丝状体寻找同源序列，3'端单链入侵并以模板为蓝图延伸合成。

5）修复完成
RAD51丝状体寻找同源序列，3'端单链入侵并以模板为蓝图延伸合成。

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为何理想的HDR在实验中并不理想？

尽管HDR可实现精准修复，但实际效率常受多重因素限制。

首先，HDR与NHEJ存在竞争，后者反应更快、更常见，常在HDR启动前完成修复。
其次，供体DNA（如ssODN或双链模板）递送至细胞核的效率低，且HDR仅在细胞周期S/G2期活跃，限制了其发生概率。
加之不同细胞类型对转染及修复反应的敏感性差异，使HDR成为“高精度、低效率”的代名词。

提高HDR效率的策略

为克服这些限制，研究者提出多种优化方案：

✅ 抑制NHEJ：应用小分子（如SCR7）阻断DNA-PKcs或Lig4活性；
✅ 调控细胞周期：通过药物或同步手段增加S/G2期细胞比例；
✅ 优化模板递送：使用AAV、LNP等系统提升供体DNA入核率；
✅ 改良Cas9：采用nickase或高保真变体减少脱靶与错误修复。

通过这些策略，部分细胞系中HDR效率可显著提升，为精确点突变和基因敲入模型的建立提供更稳健的途径。

结语

CRISPR/Cas9结合HDR，为精准基因编辑奠定基础。尽管效率仍待提升，但其潜力正不断被释放——让“定制化基因修饰”从概念逐步走向常规。

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