【干货分享】Donor模板设计
Prime Editing
通过CRISPR-Cas9技术对细胞内的基因组DNA产生了双链断裂后，同时引发了细胞内的DNA修复机制。
因此，为了使DNA在修复过程中能通过同源重组的方式修复DNA并引入突变位点或敲入序列，则需要为细胞提供额外的同源修复模板。这个模板由5’端同源臂、突变位点（或敲入序列）和3’端同源臂组成。
Donor模板的设计对同源重组的效率具有重要的影响，下面为几个设计Donor模板的原则与建议。
ssODN（single-stranded oligodeoxynucleotide）和dsDNA（质粒DNA）均可作为Donor模板。两者各有优点，可根据实际情况选择。
ssODN长度通常为120–200 bp，可通过化学合成获得。虽然两侧同源臂相对较短（通常为40–90 bp），但在许多细胞类型中仍可获得较高的同源重组效率。ssODN对细胞刺激较小，不易触发先天免疫反应，因此可以提高转染量以提升HDR效率。
dsDNA则适合长片段的基因敲入和因同源区序列复杂而需要延长同源臂长度等应用场景。但dsDNA也存在一些风险，如dsDNA对细胞的刺激较大，容易被细胞中的免疫机制误判为游离的DNA而启动细胞凋亡，降低获得阳性克隆的概率。同时大量的dsDNA存在于细胞内时，容易随机整合至基因组中，可能导致插入突变或基因组不稳定。
图 1. dsDNA和ssDNA模板在细胞毒性和随机插入方面的对比
- 根据上述ssODN和dsDNA的特点，那么构建点突变细胞系时，可使用ssODN为Donor模板。当编辑位点前后区域的序列复杂，可考虑采用以下方法优化实验设计：
A.适当延长ssODN的同源臂的长度来提高重组效率
B.适当增加ssODN的用量
C.使用质粒DNA作为Donor模板
而基因敲入细胞系可以使用ssODN或者dsDNA。较小的片段（如只是引入小标签等）可以使用ssODN；长片段敲入则需要用质粒法构建dsDNA载体。敲入片段的长度尽可能短，敲入片段的长度与HDR同源重组效率相关。
同源臂的长度与同源性程度对重组效率具有重要的影响。同源臂长度通常为每侧500–1000 bp，插入片段越大，同源臂可适当加长以提高HDR效率。
在同源臂模板的选择上，同源臂建议以目的细胞基因组为模板进行扩增，避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源，降低重组效率。
HDR修复后，靶位点如果仍保留完整的gRNA识别序列及PAM时，Cas9可能再次切割，引发非预期突变。 为避免重复切割，可在Donor模板中引入PAM或邻近序列的同义突变，使其不再被Cas9识别。
- 在基因敲入的Donor模板设计中，可以考虑做密码子优化。旨在通过调整外源基因序列中的密码子使用频率，使其与目标宿主细胞的翻译机制高度匹配，从而提升基因表达的效率和准确性。
- 一般而言，Donor模板为ssODN时，不引入抗性标记，因为ssODN的容量低不足以引入抗性标记，且ssODN的重组效率较好，所以后续筛选也较为容易。
- 而Donor模板为质粒DNA时，则可以考虑引入抗性标记，方便后续阳性克隆的筛选。
- 除抗性标记外，也可引入荧光报告基因用于可视化筛选，但需考虑外源基因长度对HDR效率的影响。
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